Світлова листова флюоресцентна мікросопія

Содержание:Вступ 3 1. Світлова листова флуоресцентна мікроскопія 6 2. Методи мікроскопії 9 Висновки 16 Список використаних джерел 17  

Вступление:Мікроскопія була і залишається важливим методом аналізу мікросвіту з того часу, коли А. Левенгук вперше описав амеби та інші мікроорганізми. «Складний мікроскоп», тобто, мікроскоп з більш ніж однією лінзою, був винайдений до того, як з’явилися перші повідомлення про існування живих мікроорганізмів. З того часу мікроскоп зазнав численних удосконалень. Найбільш значущими подальшими технічними досягненнями для вивчення мікросвіту є: винахід електронного мікроскопа (1932 р.), метод фазового контрасту (1935 р.), винаходи конфокального мікроскопа (1955 р.), атомно-силового мікроскопа (АСМ) (1986 р.), флуоресцентного мікроскопа (2006 р.) та їх похідних. Розробка нових методів прижиттєвої мікроскопії клітин еукаріот нині є одним із актуальних завдань сучасної біології. На базі прижиттєвої мікроскопії обґрунтовано значну кількість напрямків досліджень. Так, прижиттєва мікроскопія гарантує проведення аналізу інтактних клітин, непошкоджених в процесі фіксації та подальшій підготовці до мікроскопії. Спостереження за живими клітинами надає дослідникам значну кількість інформації, отримати яку не є можливим ніякими іншими методами. Внаслідок цього, світлова мікроскопія вже сотні років продовжує залишатися актуальним інструментом біологів. Флуоресцентна мікроскопія дозволяє виявляти досліджувані клітинні структури, досягаючи при цьому дуже високої специфічності і чутливості. Прижиттєва мікроскопія дозволяє проводити ефективний аналіз міжклітинних контактів і міжклітинної взаємодії, результатів впливу на клітину різних фізичних і хімічних факторів. Основним приладом для дослідження флуоресценції двовимірних біологічних зразків є флуоресцентний мікроскоп. На початкових етапах розвитку флуоресцентної мікроскопії як джерело випромінювання використовувалася ртутна лампа, з якої фільтрами виділявся потрібний діапазон спектру. Відомо, що метод флуоресцентної мікроскопії використовується в медицині для виявлення цілого ряду патогенних бактерій – збудника туберкульозу, гонореї, дифтерії, поворотного тифу, дозволяє вести підрахунок бактерій в препаратах з невисоким їх вмістом; у біології при дослідженні клітинних мікроструктур, які вибірково поглинають флуорохроми; у металографії при вивченні структури металу і виявленні дефектів в сплавах; у криміналістиці для виявлення мікрочастинок біологічних тканин. Безперечно, флуоресцентна мікроскопія знаходить широке застосування в біології для дослідження різноманітних біологічних структур. Однак хвильова природа світла обмежує дозволи цього методу величиною близько Х / (2ІЛ), де X – довжина хвилі флуоресценції, а ІЛ – числова апертура об’єктива, що використовується. Фундаментальні процеси дифракції світла призводять до неможливості поділу точкових об’єктів, розташованих ближче певної відстані. Цей феномен був вперше описаний Ернстом Аббе в 1873 р. і отримав назву дифракційної межі, або межі Аббе. При спостереженні точкового джерела за допомогою оптичного мікроскопа, залежність розподілу освітленості від координат в площині зображення описується за допомогою так званої функції розсіювання точки (point spread function, PSF). Для оптичної системи без аберацій функція розсіювання точки є центральним максимумом і ряд побічних максимумів, розташованих симетрично щодо оптичної осі. Декілька нових підходів, розроблених в останні роки для флуоресцентної мікроскопії, дозволили досягти розділення порядку десяти нанометрів. Методи об’єднали терміном флуоресцентна наноскопія. Німецькі вчені Ш. Хелль і М. Боссі у 2006 р. розробили метод STED (Stimulated Emission Depletion) з використанням двох лазерних променів, які впливають на флуоресцентні молекули і мікроскоп нового покоління – наноскоп, який дозволяє спостерігати об’єкти розміром близько 15 нм, тобто дозволяє зазирнути, наприклад, всередину клітини. Раніше вважалося, що це неможливо. Е. Бетціг і В. Мернер, працюючи окремо один від одного, заклали наукову базу для створення іншого методу – Single Molecule Microscopy, заснованого на можливості «вмикати» і «вимикати» флуоресцентне світіння кожної окремої молекули. Завдяки цим відкриттям стало можливо спостерігати біохімічні процеси, що відбуваються на внутрішньоклітинному рівні: переміщення макромолекул у живих клітинах, рух білків. Зокрема, стало можливо спостерігати синапси, відстежувати рух білків, пов’язаних з хворобами Паркінсона та Альцгеймера, спостерігати за поведінкою заплідненої яйцеклітини. Ш. Хелль, Е. Бетціг і В. Мернер у 2014 р. нагороджені Нобелівською премією. Серед українських вчених варто відзначити випускника біологічного факультету Київського університету кандидата біологічних наук, професора Брайона Олександра Володимировича. Протягом багатьох років О. Брайон досліджував природну флуоресценцію тканин і клітин вегетативних органів рослин, ініційовану синьо-фіолетовим та ультрафіолетовим промінням. Отримані дослідником нові оригінальні дані знайшли відображення у його статтях і монографіях. Ці роботи розкривали зв’язок природної флуоресценції хлорофілу рослин з фотосинтезом листків, аналізували наслідки адаптації різних структур до холоду і дії низьких температур, а також зміни стану хлоропластів у зимових умовах. Основну увагу дослідник приділяв функціональній ролі хлоропластів. У 1973 р. вийшла його монографія «Флуоресцентна мікроскопія рослинних тканин і клітин», у якій автор детально проаналізував перспективність та інформативність флуоресцентної мікроскопії, можливості її використання для діагностики живих, пошкоджених та мертвих клітин рослинного організму за умов дії несприятливих факторів довкілля 1; 2; 3.      

Выводы:Використання світлової листової флуоресцентної мікроскопії надає можливість вивчати функціонально-морфологічні зміни клітин і їх окремих структур в різних функціональних станах. У люмінесцентній мікроскопії використовують освітлення препаратів як зверху (через об’єктив, який в цьому випадку служить і конденсором), так і знизу, через звичайний конденсор. Спостереження при освітленні зверху інколи називають «люмінесцентною мікроскопією у відбитому світлі» (цей термін умовний – збудження світіння препарату не є простим віддзеркаленням світла). Його часто використовують спільно з спостеріганням за фазово-контрастним методом в прохідному світлі. Метод знайшов широке застосування в мікробіології, вірусології, гістології, цитології. Таке різноманіття застосувань пояснюється дуже високою колірною чутливістю ока і високою контрастністю зображення об’єкта, що сам світиться на темному нелюмінесціюючому тлі. Крім того, інформація про склад і властивості досліджуваних речовин, яку можна отримати, знаючи інтенсивність і спектральний склад їх люмінесцентного випромінювання, має величезну цінність.    

Литература:1. Брайон О. В. Флуоресцентна мікроскопія рослинних тканин і клітин. К.: Вища шк., 1973. 144 с. 2. Олександр Володимирович Брайон (до 70-річчя від дня народження). Український ботанічний журнал. 2006. Т. 63, № 6. С. 868–870. 3. Брайон А. В. Флуоресцентно-микроскопическое исследование некоторых физиологических свойств тканей и клеток многолетних растений : автореферат дис. … на соискание учен. степени канд. биол. наук : 101. Киев, 1968. 19 с. 4. Особливості індукції флуоресценції хлорофілу в листках деревних рослин в умовах урбанізованого середовища / Н. О. Олексійченко та ін. Біоресурси і природокористування. 2013. Т. 5, № 5-6. С. 107–112. 5. Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов : учебно-методическое пособие. 3-е изд. Санкт-Петербург, 2014. 108 с. 6. Бисерова Н. М. Методы визуализации биологических ультраструктур: подготовка биологических объектов для изучения с помощью электронных и флуоресцентных конфокальных лазерных микроскопов : практическое руководство / отв. ред. В. В. Малахов. Москва : Т-во науч. изд. КМК, 2013. 104 с. 7. Костенко С., Китаєв О., Ковалевський С. Індукція флуоресценції хлорофілу листків представників роду Philadelphus L. в умовах міста Києва. Науковий вісник НЛТУ України. 2014. Вип. 24.4. С. 209–213. 8. Кухарська М. О. Індукція флуоресценції хлорофілу в листках представників роду Catalpa Scop. у вуличних насадженнях м. Київ. Агробіологія. 2012. № 8. С. 93–97. 9. Китаєв О. І., Кривошапка В. Діагностика функціонального стану плодових рослин методом індукції флуоресценції хлорофілу. Садівництво. 2012. Вип. 66. С. 215–221. 10. Показники індукцій флуоресценції хлорофілу у рослин Lupinus Luteus, вражених карбонатним хлорозом за обробки колоїдними розчинами Zn та Fe / М. Ф. Стародуб та ін. Науковий вісник Національного університету біоресурсів і природокористування України. Сер. Біологія, біотехнологія, екологія. 2014. Вип. 204. С. 78–86. 11. Присяжнюк О. І., Коровко І. І. Розроблення методу експрес-діагностики стану фотосинтетичного апарату рослин цукрових буряків на основі інтенсивності флуоресценції хлорофілу. Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. 2014. № 3. С. 72–76.